细菌内毒素检测专题

随着细胞和基因类治疗技术的不断发展，其使用的安全性一直是大家关注的焦点。明鉴技术团队将推出系列专题，带大家了解细胞类产品使用前必做的检测项目。

细菌内毒素又称为“热原”，是革兰氏阴性菌细胞壁上一种由脂多糖（LPS）、蛋白质和磷脂组成的高分子量复合物。在环境中无处不在，其体积小、化学稳定性高、具有较高的热稳定，所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活。

细菌在正常状态下一般不释放细菌内毒素，只有当细菌凋亡、自溶、繁殖或者黏附在其他细胞时，才表现出毒性。细菌内毒素的化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。类脂A是内毒素发挥毒性活性的主要成分，其具有免疫原性，注入动物体内可以产生相应抗体，但无中和作用。

细菌内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上，其没有种属特异性，各属细菌的类脂A结构相似。因此，各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。

细菌内毒素检测是制药和生物医学行业的基本安全要求。微量的内毒素进入机体即能引起极广泛的生物作用及病理作用，如发热、血压降低、寒颤、引起弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation；DIC）、内毒素败血症等一系列临床反应。因此，任何进入人体的药品，包括肠胃外药品和注射装置，必须在投放市场之前进行符合各国药典法规要求的内毒素检测。此外，生物医药中的注射类产品，由于药品特性，在制药用水、原辅料、包材、半成品和成品在生产过程中和稳定性储存等整个周期，对细菌内毒素的控制都很严格。迅速准确地检测细菌内毒素指标，对于生物医药企业来说至关重要。

1.热原检查法

热原检查法通常以家兔作为试验介质，将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

实践中发现此方法存在以下局限性：1）动物个体差异较大；2）精密度和灵敏度差；3）重复性差；4）只能对内毒素进行定性检测，不能进行定量检测；5）该方法耗时长、成本高。

2. 细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。其原理主要依靠细菌内毒素活化鲎试剂中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化外加的显色基团的原理，来检测细菌内毒素的量。

鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物"鲎"的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，是经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。LAL/TAL是鲎Limulus amebocyte lysate （LAL) 或 Tachypleus tridentatus （TAL）血细胞的水提取物。LAL/TAL来源分别是大西洋鲎（Limulus polyphemus）和东方鲎（Tachypleus tridentatus Leach）。鲎试剂因能与细菌内毒素及β-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。

该方法作为兔热原检测法的一种替代，已经十分成熟，是目前检测内毒素最精准、最常用的方法。具有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员的高度关注，用于检测药品及其中间品中内毒素的污染。

该方法包括凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

2.1 凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。凝胶法的优点是操作简便，供试品在排除干扰作用后均可使用凝胶法进行检验。

凝胶法的干扰试验是确定供试品能否使用凝胶法的决定因素。进行干扰实验时，应挑选与鲎试剂反应呈阴性的样品进行。若样品稀释到仍不能排除干扰作用，应进一步对供试品的前处理进行研究，再用干扰试验验证能否使用凝胶法。

该方法无需专用检测设备，经济实用。通过观察有无凝胶形成作为反应的终点，实验过程操作简单、便捷，可进行大量样品的检测。此外，该方法较任何内毒素检测法都要灵敏，且特异性强。

2.2光度测定法

光度测定试验需在特定的仪器中进行，实验操作过程对人员要求较高。该方法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测。

2.2.1 浊度法

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒索含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的措化关系来测定内毒素含蜇的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

此法操作简单、快速、灵敏度高、检测范围宽，但需要精密的专用仪器。

细菌内毒素检测—浊度法

2.2.2 显色基质法

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。

该方法不依赖凝固蛋白形成凝胶，因而抗干扰能力较强。特别适合于疫苗等生物制品以及血液、尿液、黄疸等临床样品的细菌内毒素检测。  

3. 重组C因子法

Lonza PyroGene重组C因子内毒素检测试剂盒（PyroGene Recombinant Factor C Endpoint Fluorescent Assay），是一种终点法、定量检测内毒素的试剂盒。C因子是鲎试剂酶促反应中的第一个组成部分，重组生产的C因子（rFC），在内毒素存在下被激活，不激活LAL级联反应中的其他酶，而是直接裂解荧光底物，释放荧光，通过建立内毒素标准曲线，可计算样品的内毒素含量。重组C因子法只需一部反应，优于传统LAL法且不依赖动物源成分-鲎血。USP美国药典、EP欧洲药典已收录重组C因子法，认可其作为细菌内毒素检测方法。

PyroGene重组C因子法，有着传统方法不具备的优势，但在稳定性与可靠性方面还需市场的检验，该方法的使用成本高昂。

4. 其它方法

随着对内毒素结构、功能与作用机制认识及检测方法研究的不断深入，在国内外，对内毒素检测方法的研究与开发日益增多。目前，除上述检测方法外，还有免疫学、生物学、流式细胞术及高效液相色谱等方法。

明鉴细胞检测参考《中国药典》2020年版（三部）通则1143细菌内毒素法、《中国药典》2020年版（四部）指导原则9251细菌内毒素法应用指导原则、《欧洲药典》和《美国药典》，可以提供符合法规规定的内毒素检测动态显色法和凝胶法，也可以提供符合CMA要求的分析报告，以满足不同样品的检测需求。