无菌检测专题

随着细胞和基因类治疗技术的不断发展，其使用的安全性一直是大家关注的焦点。明鉴技术团队将推出系列专题，带大家了解细胞类产品使用前必做的检测项目。

无菌检查法系用于检査药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查法是为检测无菌工艺产品和终端灭菌产品的无菌性而建立的，是在药典规定的培养条件下检查活的可培养微生物的一种定性检查方法。

生物制品，作为药典要求(USP<71>, EP2.6.1, JP 4.06, 中国药典1101)的无菌药品之一，必须在放行之前完成无菌检查。

人用药品注册技术国际协调会议（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）建议对来自细胞库的至少1%或至少两支冻存细胞进行无菌检测。通常在检测之前进行抑制细菌/抑制真菌试验，以确定供试品对微生物生长有无抑制作用。

•中国：中国药典三部（2020版）-通则-1101无菌检查法:

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测。

•美国：美国药典USP31-NF26无菌检查法《71》：

只要其性质许可，这些药品将使用膜过滤法来检测。如果膜过滤技术是不合适的，则使用培养基直接接种法。除了具有标记为无菌通道的设备外，所有的设备均需使用培养基直接接种法进行检测。

由于无菌检查法是一个非常精确的程序，在此过程中程序的无菌状态必须得到确保以实现对结果的正确理解，因此人员经过适当的培训并取得资质是非常重要的。无菌检查要在无菌条件下进行。为了实现这样的条件，试验环境必须调整到适合进行无菌检查的方式。为避免污染而采取的特定预防措施应不会对任何试图在检查中发现的微生物产生影响。通过在工作区域作适当取样并进行适当控制，来定期监测进行此试验的工作条件。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

薄膜过滤法：一般应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米 ，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

该方法周期长，总检测时间不少于14天，其适用范围广，不受样本量限制，也不受抑菌物质干扰。

直接接种法：适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。

该方法周期长，总检测时间不少于14天，易受供试品中的抑菌物质干扰，操作简便，能用于无需预处理的样本检测，如样本量较少的细胞上清、一次性注射针头等。

本公司除了具有中国药典规定的无菌检测方法外（包括薄膜过滤法和直接接种法），还依据欧洲药典EP2.6.1开发了针对细胞类产品快速放行的全自动微生物检测技术。

1. BacT/ALERT 3D自动培养法原理：

BacT/ALERT 3D 系统采用非侵入性方法检测。如果检测样品中存在微生物，当微生物代谢培养基中的底物时，就会产生二氧化碳。当微生物生长产生CO₂时，每个培养瓶底部的传感器颜色就由深变浅。发光二极管（LED）将光线投射到瓶底传感器上，再由一个光电探测器测量反射单元。产生的CO₂越多，反射单元值越高。将此读数与传感器最初的读数相比较。如果最初CO₂水平较高、CO₂生成率异常地高、和/或持续生成CO₂，样品则被判定为阳性。也可根据所生成CO₂的差值或缓慢持续改变判定。如果在适当条件下经过一定天数后，CO₂水平无显著改变，则判定样品为阴性。

2. BacT/ALERT 3D自动培养法优点：

（1）内含孵育箱，自动样品检测，提高了效率，系统无需随时监控，节省人力；

（2）基于生物梅里埃的检测技术，BacT/ALERT 3D显示出了的性能，对大范围内的微生物，95%可在24小时内报阳，98%可在72小时内报阳，相对中国药典薄膜过滤法，大大缩短了结果报告时间；

（3）BacT/ALERT 的技术可检测需氧和兼性厌氧微生物，即使是粘性、浑浊、含有抑菌物质的样品也可获得客观的结果；

（4）连续性的样品监测，一旦出现阳性立即报警使用者，数据可以永久的以电子文档储存，便于后续追踪、查询。