支原体检测

随着细胞和基因类治疗技术的不断发展，其使用的安全性一直是大家关注的焦点。明鉴技术团队将推出系列专题，带大家了解细胞类产品使用前必做的检测项目。

支原体（Mycoplasma）是一类介于细菌和病毒间能独立存活、广泛存在的微生物，是已知最小的、可自我复制的原核细胞型微生物。它具有结构简单、个体微小及呈高度多形性等特点，大小为0.1～0.3 μm，可通过0.2 μm的常规滤器。

支原体是体外培养细胞的重要污染源。据统计，全世界范围内约15%～50%的保藏细胞受到支原体的污染。引起体外细胞污染的支原体主要有口腔支原体（Mycoplasma orale）、发酵支原体（Mycoplasma fermentans）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）、莱氏无胆甾原体（Acholeplasma leyeri）等20余种。细胞受支原体污染程度较轻时，一般难以察觉，易被忽视。但被支原体严重污染时，可导致细胞生长缓慢甚至死亡。支原体染污的来源包括操作人员、原辅料、设备、环境和方法等。用于生物制品生产的细胞基质或治疗性细胞制品被支原体污染后，支原体将伴随制品进入体内，并对人体产生严重危害。因此，对生物制品生产的细胞基质或治疗性细胞制品的支原体检查是确保产品质量的前提。

支原体检测属于药品监管要求的一部分，2020版《中国药典》三部在生物制品生产检定用细胞基质制备及质量控制和3301支原体检查法中，针对生物制品支原体检测做出了说明。必须在产品开发的各个阶段开展支原体检测，包括原辅料、细胞库、病毒种子库、收获液、半成品和终产品等。

中国药典3301指出主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。此外，FDA、WHO等不同国家和地区监管机构和USP、EP等法规也对支原体检测提出了要求，主要包括测试细胞库（主细胞库、工作细胞库等），收获前的下游细胞培养物，终产品以及对照细胞等是否受到支原体污染。支原体的检测方法有 10 多种，每种检测方法各有利弊，不同方法的支原体检出率也有差别。根据制品特性选择快速、准确、有效的检测方法，有助于促进产品的开发、制造和放行，确保产品质量。

检测样本直接接种至液体培养基中，在支原体数目增长到一定程度之后，培养基中的pH值会发生显著变化，如果在培养基中添加指示剂，这种变化会非常直观地显现出来。该方法具有广谱性，但敏感性低，实验周期较长，总检测时间为28天。

指示细胞培养法（DNA染色法）是用无支原体污染的Vero细胞或其它细胞作为指示细胞，结合DNA荧光染料染色，在荧光显微镜下进行观察和评估。被支原体污染的指示细胞，除了细胞核发出荧光外，细胞表面和周围区域也会出现大小不等、不规则的荧光特征。该方法与培养法一样具有广谱性，但亦存在敏感性低，实验周期较长等缺点。

核酸扩增技术（Nucleic acid amplification technique，NAAT）是近年来发展起来的检测方法，包括巢式PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR等，具有快速、特异、敏感及高效等特点，可以同时检测多种支原体的污染。

因其阳性检出率往往受到引物所能扩增的支原体种类的制约，且容易受到样品核酸提取方法、与支原体亲缘关系较近的基因干扰等外源因素的影响。因此，需要与传统方法进行比较研究，以证明方法的等效性。作为替代方法，NAAT检测方法需确证能达到法规所要求的检测灵敏度。检测灵敏度达到10CFU/mL，可替代培养法；达到 100CFU/mL，可替代指示细胞培养法。

支原体酶广泛存在于180多种支原体以及六大主要支原体污染细胞培养物中，但不存在于真核细胞中。因此检测有无支原体酶，成为快速、灵敏的支原体污染的检查方法之一。

该方法通过裂解支原体，将裂解释放的支原体酶与支原体检测试剂盒底物作用，催化ADP变成ATP，并在荧光素酶的作用下产生光信号，由光度计读出数值。通过检测底物加入前后样品发光强度的变化，可判断是否存在支原体污染。

该方法可快速、有效、高灵敏度地检测出支原体污染，在细胞培养过程中可随时取少量培养上清，监测是否有支原体污染，满足细胞产品快速放行检测需求。

截至目前，培养法和指示细胞培养法是各国药典均使用的支原体检测“黄金标准”，普遍应用于主细胞库、种子细胞库、病毒种子批等的检测。欧洲药典6.1版本将支原体核酸扩增检测方法列为在培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）之后的第三种被认可的方法，在经过充分的验证之后可用于细胞制剂的快速放行检测。

明鉴细胞检测参照中国药典和欧洲药典，可提供符合法规要求的培养法和指示细胞培养法支原体检测服务，也可为生物制品生产企业及科研院所提供基于核酸扩增技术（NAT）的qPCR法和化学发光法快速支原体检测服务，最快可1小时出具检测报告，同时，还可提供临床备案和药品申报所需的支原体检测验证服务。