人源病毒检测专题

随着细胞和基因类治疗技术的不断发展，其使用的安全性一直是大家关注的焦点。明鉴技术团队将推出系列专题，带大家了解细胞类产品使用前必做的检测项目。

外源因子污染，尤其是病毒污染，是威胁治疗用生物制品用药安全的重要风险之一。历史上，由于人们对病毒污染风险认识不足，病毒检测技术和病毒灭活/去除技术等病毒污染防控措施存在局限性，曾发生过治疗用生物制品被外源病毒污染的事件，给产品使用带来极大的安全性隐患，并影响公众对治疗用生物制品的信赖。随着生物技术的快速发展，治疗用生物制品类别呈现多样化，但不管哪类产品，均存在潜在的污染外源因子的风险。因此，病毒污染防控工作是保障生物制品安全性的重要工作内容。

各国药品监管机构以及工业界都极其重视生物产品病毒污染的安全风险问题。近年来，陆续发布相关技术法规和技术指南，旨在提高对病毒污染风险意识、加强控制措施，确保产品的安全。

国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5A规定：对治疗用生物制品生产用细胞系和包括培养基在内的其他原料进行选择和检测，以确保其不含可能对人有感染和（或）致病作用的病毒；对生产工艺中清除感染性病毒的能力进行评估；在生产的适当步骤对产品进行测试，确保产品不存在感染性病毒的污染。

2020年版《中国药典》（三部）《生物制品病毒安全性控制》指出：生物制品病毒安全性控制应体现在生物制品质量控制的全过程。其基本要素包括对生产过程使用的相关物料（起始原材料、原材料和辅料）的来源控制、病毒污染筛查或处理，生产工艺对病毒的清除作用，以及对产品（包括中间产物和成品）病毒污染的检测；人源的细胞系/株，应考虑检测如人EB病毒、人巨细胞病毒（HCMV）、人逆转录病毒（HIV-1/2、HTLV-1/2）、人肝炎病毒（HAV、HBV、HCV）、人细小病毒 B19、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、难培养的人腺病毒和人疱疹病毒-6/7/8等。

2020年版《中国药典》（三部）《生物制品病毒安全性控制》指出：应结合品种特点和具体生产情况的综合分析，设计并选择适宜的方法对潜在污染病毒进行检测，如细胞培养法、核酸扩增技术等。为提高病毒检出率，应尽可能采用先进的技术和方法用于病毒污染的检测。病毒检测阴性不能完全证明无病毒污染存在，应排除因取样量不足、病毒含量低于检测方法的灵敏度，或检测方法不适用等导致病毒检测结果阴性的情况。

1. 体外指示细胞法

体外外源病毒因子检测所需的多种指示细胞系需要根据生产用细胞系的历史和物种进行选择。2020年版《中国药典》（三部）《生物制品生产检定动物细胞基质制备及质量控制》中指出：用待检细胞培养上清液制备活细胞或细胞裂解物，分别接种至少下列三种单层指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属、同组织类型来源的细胞。

根据ICH和EU指南，测试中所用指示细胞需根据待试细胞库的物种来源而定，但必须包括对人病毒敏感的人和/或非人类灵长目动物细胞系，以确保能较为广泛的检测到人和有关动物的病毒。

该检测方法耗时较长。若已知待检细胞可支持人或猴巨细胞病毒 (CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变，且血吸附试验及红细胞凝集试验均应为阴性。

2. 体内动物接种法

用待检细胞培养上清液制备活细胞（或适宜时采用相当量的细胞裂解物），接种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计4组。接种一段时间后，检查是否有疾病或感染的症状。

该检测方法耗时较长。豚鼠实验至少观察 42 天，观察期末解剖所有动物。

3. qPCR法

根据ICH指南，如果用于生产的细胞系为人类或非人类灵长动物来源，除非另有说明，否则应对人类病毒（如引起免疫缺陷性疾病和肝炎的病毒）进行检测。检测这些特定病毒，可利用针对病毒序列的特异性引物，进行qPCR扩增，产生多个拷贝，使其更容易被检测到。

该方法快捷灵敏，但仅限于检测已知特定病毒。

人巨细胞病毒定量检测

4. 免疫荧光法

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是一项建立在免疫学、生物化学和显微镜技术基础上的实验技术，既有免疫学反应的特异性和敏感性，又有显微镜技术精确性和直观性的优点。

免疫荧光技术有两种检测方法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法，以荧光抗体方法较常用。

免疫荧光技术可用于鉴定病毒抗原，目前被广泛应用于临床样本病毒感染的快速检测。

5. 病毒安全性检测新方法与新趋势

目前一些新兴技术，正在逐渐用于病毒的检测，如NGS（二代测序）、简并PCR、DNA芯片、多重PCR联合核酸质谱分析技术等。其中NGS展示出很强的优势，可测定DNA或RNA序列，该技术具有不需要任何序列信息的优势。因此，NGS原则上可以检测和鉴别样本中的所有序列。

该方法检测广度最高、灵敏度高。

明鉴细胞检测依据相关法规，参考现有行业检测技术，可提供符合法规规定体外指示细胞法、体内动物接种法和qPCR法检测，出具定性或定量病毒因子检测报告。

明  鉴 细 胞 检 测