间充质干细胞生物学效能专题

随着细胞和基因类治疗技术的不断发展，其使用的安全性一直是大家关注的焦点。明鉴技术团队将推出系列专题，带大家了解细胞类产品使用前必做的检测项目。

干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，人间充质干细胞（hMSCs, human mesenchymal stem cells)是其中的重要研究分支。hMSCs存在于不同组织间质或血管周围，形态类似于成纤维细胞，在多种疾病的治疗中有很好的应用前景，已成为临床应用和研究发展最为迅速的一类干细胞。其生物学有效性是临床前研究阶段hMSCs产品综合质量评价的重要内容，可归为三类：多向分化潜能、免疫调控功能和组织再生功能。

多向分化潜能是指hMSCs在特定体外诱导分化培养条件下，具有向内、中、外胚层不同细胞系列分化的潜能；免疫调控功能指hMSCs可与机体内几乎所有的免疫细胞相互作用并调节其功能，用于改善局部病损组织的微环境、抑制过激的炎症反应或调控异常免疫反应；而组织再生功能则是指相对独立于诱导分化功能和免疫调控功能，直接促进病损组织细胞修复和/或再生的一系列生物学功能的总和。

生物学效能评价是用于预测或确保相关产品临床治疗有效性的重要依据，由于如何有效预测干细胞临床治疗的有效性是影响其产品研发的关键瓶颈因素，因此对hMSCs生物学效能的评价便显得十分重要。在产品研发的整个周期中，相关细胞产品从产品早期研发、临床前研究、临床研究申报（注册或备案）、临床研究结果评价、上市前审批、上市后再评估的过程中，均有不同程度的生物学效能评价的内容要求，对生物学有效性的要求会越来越高。

在2015年国家卫生计生委与食品药品监管总局共同颁布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》的文件中，要求已备案的临床研究机构，应用的干细胞制剂在制备和使用过程中，必须按照严格的标准操作程序执行，以确保干细胞相关制剂的质量可控，保障治疗的安全性和有效性。

   《原则》要求可通过检测干细胞分化潜能、诱导分化细胞的结构和生理功能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子、表达特定基因和蛋白等功能，判断干细胞制剂与治疗相关的生物学有效性。

对间充质干细胞，无论何种来源，应进行体外多种类型细胞（如成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞等）分化能力的检测，以判断其细胞分化的多能性（Multipotency）。对未分化的人胚胎干细胞（human embryonic stem cell, hESCs）和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），须通过体外拟胚胎体形成能力，或在SCID鼠体内形成畸胎瘤的能力，检测其细胞分化的多能性（Pluripotency）。除此以外，作为特定生物学效应试验，应进行与其治疗适应证相关的生物学效应检验。

（1）间充质干细胞三系分化：在体外条件培养基诱导培养下，hMSCs能够分化为成脂肪、骨、软骨细胞。

成骨分化： 多种刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，hMSCs定向分化为骨原细胞；其后，骨原细胞进一步分化为成骨细胞前体细胞，进入快速增殖期；细胞增殖能力逐渐下降，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）成熟相关基因（碱性磷酸酶、I型胶原、基质钙蛋白）被进一步激活，成骨细胞在此阶段合成和分泌有机基质，形成类骨质，主要由I型胶原形成，特征物是碱性磷酸酶，是成骨细胞分化成熟的早期标志；成熟的成骨细胞表达ECM钙化相关蛋白，主要是骨钙蛋白和骨桥蛋白，成骨细胞矿化活力显著升高。体外诱导成骨分化的鉴定主要是通过检测成骨细胞的生物学标志以及相关的标志基因来进行。短期的成骨分化可通过碱性磷酸酶来检测，长期的成骨分化则通过检测茜红素染色骨结节来鉴定。

成骨

成脂分化：hMSCs成脂分化有两个阶段，先是hMSCs分化为脂肪前体细胞，接着在特定的细胞刺激影响下（如C/EBPs和PPAR-γ）最终分化为脂肪细胞，出现脂肪细胞中显著的标志物（脂肪滴）。脂肪滴经油红O染色后在显微镜下呈现显著的红色，未分化细胞则无明显颜色。通过统计各样品中成脂分化细胞的百分比来对成脂分化强弱加以表征对比。

成脂

成软骨分化：hMSCs首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Westernblot检测II型胶原蛋白的表达和RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达，不同的角度进行鉴定；而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。

成软骨

（2）免疫调控： 干细胞具有旁分泌效应，可以通过分泌一些炎症相关因子，抑制免疫过激反应。例如：干细胞可以通过分泌TGF-β和PEG-2，抑制NK细胞的增殖；可以通过产生的细胞因子抑制T免疫细胞的增殖，影响其免疫反应，起到免疫调节的作用；能够通过上调Treg细胞抑制促炎症因子IFN-γ的释放，上调Th2促进抗炎因子IL-4的释放，其分泌的INF-γ、IL-10、HGF等细胞因子，具有很好的抗炎作用。通过流式细胞术检测共培养过后细胞上清中的细胞因子，鉴定hMSCs的免疫调控功能。

淋巴细胞增值抑制率

（3）组织再生：组织再生功能是指受损的组织细胞在经历损伤及炎症反应后所表现的修复或愈合过程。hMSCs的组织再生功能主要表现为保护组织细胞抗凋亡损伤、促血管形成、促进巨噬细胞从M0/M1型向M2型极化、促进组织内源性干细胞或前提细胞增殖和分化、促进已分化的组织细胞发生跨系分化（trans-differentiation）以代偿损伤的组织细胞等。

明鉴细胞检测依据《中国药典》2020版和相关法规，参考现有行业检测技术，可提供符合法规规定的间充质干细胞三系分化检测和免疫调控能力检测，以及用于临床备案和药品申报的检验检测报告。